Efecto de la motilidad espermática en la producción de embriones in vitro en bovinos

Universidad Nacional Agraria La Molina. Escuela de Posgrado. Maestría en Producción AnimalEl sistema computarizado de análisis de semen y la fertilización in vitro son herramientas útiles para predecir la fertilidad. El presente estudio se realizó con el objetivo de evaluar el efecto de la motilidad espermática en la producción de embriones in vitro en bovinos, la investigación se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Reproductiva, de la Universidad Nacional Agraria La Molina. Los ovarios fueron colectados del camal y transportados en termos con solución fisiológica a 35 ºC. La aspiración de los complejos cúmulos ovocitos (COCs), se realizó aproximadamente dentro de 3 horas después de beneficiados los animales, se aspiraron con PBS+ 1% SFB, los folículos entre 3 a 8 mm de diámetro, con aguja nº 18, Los COCs se categorizaron de acuerdo a la morfología de las células del cúmulus ovocitos, seleccionándose los COCs de calidad A y B. colocándose en placas petri con gotas de medio maduración, donde se llevó a la incubadora a 38.5 ºC y 5% de CO2 por 22 horas, para luego ser fecundados in vitro por 18 horas previo tratamiento espermático con gradiente de percoll 45/90 y medio capacitante, evaluándose con el Sistema computarizado de analisis de semen parámetros de motilidad espermática como velocidad curvilinea (VCL), Velocidad media (VAP), velocidad rectilínea (VSL), índice de linealidad (LIN), índice de rectitud (STR), índice de oscilación (WOB), desplazamiento lateral de la cabeza (ALH) y Frecuencia de batida (BCF). Una vez finalizada la etapa de fecundación, se trasladaron en un medio para cultivo, a las 48 horas se realizó la primera renovación del 50% de medio de cultivo, para el día 5 se realizó la segunda renovación del 50% de medio de cultivo. Posteriormente para el día 7 se obtuvieron los embriones en el estado de blastocisto y/o blastocisto expandido. Para la evaluación de los parámetros de motilidad espermática se utilizó un diseño de bloques completamente al azar y para la correlación de parámetros de motilidad con la producción de blastocistos se utilizó correlación de pearson. Se encontró que los parámetros de velocidad espermática como VCL, VSL y VAP son superiores estadísticamente (P≥0.05) entre 13 a 14 µm/s y los parámetros de angularidad y oscilación de la cabeza como LIN, STR y WOB entre 6 a 8% en muestras de semen posterior a la selección y capacitación espermática en comparación a las muestras de semen post descongelado. Y estas se encuentran correlacionadas positivamente entre sí.The computerized system of semen analysis and in vitro fertilization are useful tools for predicting fertility. The present study was conducted with the objective of evaluating the effect of sperm motility on the production of embryos in vitro in cattle, the research was carried out in the Laboratory of Reproductive Biotechnology, National University Agrarian La Molina. The ovaries were collected from the slaughterhouse and transported in terms with physiological solution at 35 ° C. The aspiration of the complex oocyte cumulus (COCs), was performed within 3 hours after the animals benefited, were aspirated with PBS + 1% SFB, follicles between 3 to 8 mm in diameter, with needle # 18, COCs were Categorized according to the morphology of the oocyte cumulus cells, selecting COCs of quality A and B. placed in petri dishes with drops of medium ripening, where the incubator was taken at 38.5 ºC and 5% CO2 for 22 hours, To be fertilized in vitro for 18 hours before spermatic treatment with gradient percoll 45/90 and capacitive medium, being evaluated with the computerized semen analysis system parameters of sperm motility such as curvilinear velocity (VCL), mean velocity (VAP), velocity Straight line index (VSL), linearity index (LIN), straightness index (STR), oscillation index (WOB), lateral displacement of the head (ALH) and beat frequency (BCF). At the end of the fertilization stage, they were transferred to a medium for culture, at 48 hours the first renewal of 50% of culture medium was carried out, for day 5 the second renewal of the 50% culture medium was performed. Subsequently for day 7, the embryos were obtained in the state of blastocyst and / or expanded blastocyst. For the evaluation of sperm motility parameters a completely randomized block design was used and for correlation betwen motility parameters and blastocysts production we used pearson correlation. Sperm velocity parameters such as VCL, VSL and VAP were statistically higher (P≥0.05) between 13 and 14 μm / s and head angularity and oscillation parameters such as LIN, STR and WOB were between 6 and 8% in Semen samples after selection and sperm training compared to post-thawed semen samples. And these are positively correlated with each other.Tesi

Integridad de la membrana citoplasmática en semen refrigerado y congelado de toros usando dos dilutores sintéticos

Universidad Nacional Agraria La Molina. Facultad de Zootecnia. Departamento Académico de Producción AnimalSe utilizaron cuatro toros de razas Simmental y Braunvieh (2 de cada raza) perteneciente a la Estación experimental Donoso del MINAGRI. Se extrajeron muestras de semen para su procesamiento (refrigeración y congelación) en el Banco Nacional de Semen evaluándose el efecto de los dilutores sintéticos Optixcell y Andromed sobre la integridad de la membrana citoplasmática. Se analizó la concentración espermática, pH, motilidad, vitalidad e integridad de la membrana citoplasmática usando solución hipoosmótica (100 mlOsm/L). Para el análisis estadístico se utilizó el paquete estadístico Minitab usando un diseño de bloques completamente al azar tomando como tratamientos a los dilutores y como bloques a cada raza de toro. Se aplicó un DBCA para las características motilidad, vitalidad y HOST espermáticos, para semen refrigerado y descongelado en ocho repeticiones. En la evaluación del semen puro se obtuvieron las medias 3.34±1.42 ml en volumen, 1442.40±327.34 millones de espermatozoides/ml de concentración, 3.8 de motilidad masal, 7 de pH y color blanco cremoso. En los resultados del ANOVA para el semen refrigerado; en la prueba de endosmosis (HOST) se obtuvo 48.97±15.23 % y 39.66±13.39% utilizando Andromed y Optixcell respectivamente encontrando diferencias significativas (P<0.05). En relación al semen descongelado se obtuvo 41.15±10.26% y 26.82±7.30% de endosmosis con Optixcell y Andromed respectivamente encontrándose también diferencias significativas (P<0.05). Por lo que se concluye que el dilutor Optixcell mejoró la conservación de la integridad de la membrana citoplasmática de espermatozoides. Con respecto a las razas, se encontró diferencias significativas (P<0.05) en la motilidad y vitalidad en semen refrigerado y descongelado. Sin embargo, en la prueba de HOST no se evidenció diferencias estadísticas (P≥0.05) tanto en semen refrigerado y descongelado.Four Simmental and Braunvieh bulls (2 of each breed) from the Donoso Experimental Station of MINAGRI were used. Semen samples were extracted for processing (refrigeration and freezing) at The National Sperm Bank and the effect of the synthetic dilutors Optixcell and Andromed on the integrity of the cytoplasmic membrane was evaluated. Sperm concentration, pH, motility, vitality and cytoplasmic membrane integrity were analyzed using hypoosmotic solution (100 mlOsm/L). For statistical analysis, the Minitab statistical package was used using a completely randomized block design with dilutors as treatments and each bull breed as blocks. A DBCA was applied for sperm motility, vitality and HOST characteristics, for refrigerated and thawed semen in eight replicates. In the evaluation of pure sperm, the means 3.34±1.42 ml in volume, 1442.40±327.34 million spermatozoa/ml of concentration, 3.8 of mass motility, 7 of pH and creamy white color were obtained. In the ANOVA results for the refrigerated semen; in the endosmosis test (HOST), 48.97±15.23 % and 39.66±13.39% were obtained using Andromed and Optixcell respectively, finding significant differences (P<0.05). In relation to the thawed sperm, 41.15±10.26% and 26.82±7.30% of endosmosis were obtained with Optixcell and Andromed respectively, also finding significant differences (P<0.05). Therefore, it is concluded that the Optixcell dilutor improved the conservation of the integrity of the cytoplasmic membrane of spermatozoa. With respect to the breeds, significant differences (P<0.05) were found in motility and vitality in refrigerated and thawed sperm. However, in the HOST test, no statistical differences (P≥0.05) were found in both refrigerated and thawed sperm

Predicción de la eficiencia de dosis seminales bovinas en inseminación artificial a tiempo fijo

Fixed-time artificial insemination (FTAI) technique is a high impact genetic improvement biotechnology applied in beef herds breeded in marginal areas of Argentina. For the success of it, one of the factors to take into account is the quality of the semen that reaches the places of application of the FTAI biotechnology. Nevertheless, to evaluate the fertilizing capacity of the semen to be used, only laboratories with a basic level of equipment are available. On the other hand, it is important to have predictive evaluation techniques, as accurate as possible, of the field behavior of the seminal doses. Three lots of 108, 94 and 50 British breed beef cows were used, and sperm motility, acrosome integrity, osmotic resistance test, endosmosis test, live/dead relationship and percentage of pregnancy of the semen used were compared under two thawing protocols. The result pointed out that the endosmosis test is a valid, low cost, objective and and of easy in laboratories with low complexity to evaluate the fertilizing capacity of bovine semen in a fixed-time artificial insemination program.Fil: Cerutti, Dante. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires, ArgentinaLa técnica de inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) es una biotecnología de alto impacto en la mejora genética en rodeos de cría en zonas marginales productoras de terneros de la República Argentina. Para el éxito de la misma uno de los factores a tener en cuenta es la calidad del semen que llega a los lugares de aplicación de la IATF. Para evaluar la capacidad fecundante del semen a utilizar se dispone de laboratorios con un nivel básico de equipamiento. Es importante contar con técnicas de evaluación predictivas de la eficiencia a campo de las dosis seminales lo más precisas posibles. En el presente trabajo se utilizaron tres lotes de vacas británicas de 108, 84 y 50 vacas, y se comparó motilidad espermática, integridad acrosómica, test de resistencia osmótica, test de endósmosis, relación vivos/muertos y porcentaje de preñez del semen utilizado sometido a dos protocolos de descongelado. El resultado indica que la incorporación del test de endósmosis es una opción válida, de bajo costo, objetiva y de fácil aplicación en laboratorios con baja complejidad para la evaluar la capacidad fecundante del semen bovino en un programa de inseminación artificial a tiempo fijo

Use of flow cytometry as a tool for the study of manchego sheep sperm characteristics during in vitro fertilization processes: relationship with in vivo fertility

Tesis Doctoral realizada por D. Enrique del Olmo de Medina, Licenciado en Biología, en el laboratorio del grupo SaBio (Sanidad y Biotecnología) del Departamento de Ciencia y Tecnología Agroforestal y Genética de la Universidad de Castilla-La Mancha (UCLM).[ES]: En los centros de Inseminación Artificial se vienen evaluando de forma rutinaria diferentes pruebas de evaluación seminal con el objetivo de discriminar aquellas muestras que no tengan una calidad seminal mínima exigida. Algunas de estas pruebas muestran una relación con la fertilidad, sin embargo, muchas veces las correlaciones encontradas entre estas pruebas de contrastación seminal y la fertilidad de los machos son mínimas. Esta pérdida de correlación puede deberse a varios motivos. Uno es que el número de espermatozoides utilizados en la inseminación artificial es elevado siendo difícil discriminar las muestras seminales subfértiles puesto que siempre habrá espermatozoides en un número elevado para fecundar los ovocitos. Otro problema, es que existen variaciones en la fertilidad dependiendo de la explotación, del manejo e incluso del inseminador siendo complicado establecer una relación directa entre la calidad seminal y la fertilidad. Finalmente, muchas de las pruebas utilizadas, como por ejemplo la motilidad, son pruebas subjetivas existiendo por tanto diferencias en las evaluaciones. No determinar de forma precoz la fertilidad supone un coste económico para los centros de sementales puesto que es posible que se mantengan animales con bajas tasas de fertilidad. Por lo tanto, determinar la fertilidad de un macho de forma temprana a partir de evaluaciones seminales eficientes mejoría el rendimiento económico puesto que aquellos machos con problemas de fertilidad podrían retirarse y no ser utilizados para inseminación artificial. El objetivo general de la presente tesis se orientó a la búsqueda de nuevos parámetros espermáticos, en muestras descongeladas de ovino, que evaluados in vitro pudieran correlacionarse con fertilidad tanto in vivo como in vitro. En primer lugar, decidimos utilizar la citometría de flujo y la evaluación de la motilidad mediante sistemas automáticos de análisis de imagen como herramientas para el análisis espermático debido al alto número de espermatozoides que estas técnicas son capaces de analizar en un breve espacio de tiempo y debido a su objetividad, y buscamos relaciones con fertilidad in vivo../..[EN]: In artificial insemination centers sperm samples are routinely evaluated by different seminal assessment tests in order to discriminate samples without a minimum required seminal quality. Some of these tests show a relationship with fertility, however, often correlations founded between these tests and contrasted male fertility is minimal. This loss of correlation may be due to several reasons. One is that the number of spermatozoa used for artificial insemination is high, it is difficult to discriminate subfertile semen samples since there will always be a large number spermatozoa to fertilize the eggs. Another problem is that there are variations in fertility depending on the operation, management and even the inseminator becoming difficult establish a direct relation between semen quality and fertility. Finally, many of the tests used, such as motility, are subjective tests therefore exist differences in assessments. Not determine fertility in an early form results in a economic cost for stallions centers since it is possible that animals are kept with low fertility rates. Therefore, determining the fertility of a male from early assessments seminal efficient economic performance improved since those males with fertility problems could retire and not be used for artificial insemination. This work was aimed towards the search of new sperm parameters from thawed ram samples, which in vitro evaluation would yield liable in vitro and in vivo fertility patterns. Firstly, flow cytometry and motility evaluation using image analysis automatic systems were used for spermatic analysis. Those techniques allow impartial and adequate sample analysis in a short time due to the high number of spermatozoa examined../..Su autor ha disfrutado del contrato asociado a proyecto (PTA2008-0858-P). Los diversos experimentos que forman parte de esta tesis han sido financiados por el proyecto PAI09-0006-3806, de la Consejería de Educación y Ciencia (JCCM). Además, el doctorando ha contado con financiación de la Fundación Enresa para realizar una estancia de 3 meses en el SLU de Uppsala (Suecia), lo que ha permitido cumplir con los requisitos para acceder a la mención de doctorado internacional.Peer Reviewe

Efecto de la adición de un surfactante natural (aloe vera) al diluyente triladyl® para crioconservación de semen bovino en toros reproductores de agso-genes, Quito-Pichincha.

La presente investigación se llevó a cabo en los laboratorios del Centro de Desarrollo Genético de la Asociación de Ganaderos de la Sierra y Oriente, ubicado en la ciudad de Quito. El objetivo principal de dicho estudio fue evaluar el efecto de la adición de un surfactante natural (aloe vera) al diluyente Triladyl, comparándolo en tres diferentes concentraciones, lo que permitirá establecer si el aloe vera disminuiría la mortalidad y mejoraría la motilidad espermática antes y después del congelamiento en nitrógeno liquido. Para evaluarlo se utilizo técnicas de valoración seminal, tanto del semen fresco como después de congelarlo, evaluando parámetros como motilidad en masa e individual, porcentaje de espermatozoides vivos y muertos, anormalidades primarias y secundarias y finalmente pruebas de integridad del acrosoma HOST y ORT. El diluyente utilizado en la investigación fue Triladyl y el surfactante natural fue el aloe vera, se utilizo las mismas condiciones de asepsia tanto al elaborar el diluyente como al procesar el aloe vera hasta alcanzar las concentraciones necesarias para la investigación. Se utilizo tres machos, el primero de raza Pizán con una edad de 1 año y medio y dos toros raza HolsteinFriesian de 3 años de edad, quienes fueron sometidos a un examen físico y clínico encontrándose en perfecto estado de salud, el semen fue colectado por el método de vagina artificial cada 15 días se procesó las muestras solamente si eran consideradas aptas hasta completar 5 coletas, se calificó el semen fresco, posteriormente se diluyeron las muestras de acuerdo a la concentración de espermatozoides del eyaculado en las tres concentraciones del aloe vera propuestas y un grupo sin aditivo, se congelo la producción de las tres concentraciones y del grupo control y se evaluó las muestras post descongelación

Modificación de la membrana espermática a través de la adición de metil -β- ciclodextrina cargada de colesterol en medios de crioconservación para bovinos lecheros.

El objetivo de este estudio fue evaluar la calidad espermática post descongelación ante el efecto de la adición de ciclodextrina cargada con colesterol (CLC) en el medio de crio preservación. La investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Reproducción Animal de la Facultad de Ciencias Pecuarias de la ESPOCH, utilizando un solo reproductor Jersey de 3 años de la Ganadería “San Diego” se utilizó vagina artificial para un total de 5 colectas, cuyas características macroscópicas fueron: (color: blanquecino de aspecto ligeramente cremoso, volumen: 8ml, pH: 6,78) y microscópicas (concentración:1040x106 spz/ml, motilidad masal: 4 puntos, motilidad individual: 87% y morfología normal: 87%). El semen pre diluido fue dividido en 3 partes iguales agregando la CLC para sus respectivos tratamientos (T0:0 mg, T1:1,5 mg, T2:3,0 mg) las cuales fueron incubadas a 37ºC por 15 minutos, pasado este tiempo se realizó la dilución final empajillándolas inmediatamente en pajuelas de 0,5 ml llevándolas al congelador automático, descendiendo la temperatura progresivamente hasta los -196ºC y almacenándolas en el tanque de nitrógeno líquido, las pajuelas fueron descongeladas cada 7 días para su respectiva evaluación. Se utilizó un Diseño Completamente al Azar obteniendo diferencias significativas P(<0,01) para la motilidad, vitalidad e integridad de la membrana con medias de 63,50%; 75,36%; 60,08% respectivamente pertenecientes al T1, en cuanto, a las morfoanomalías no se encontraron diferencias estadísticas, siendo el T2 quien presento mayor porcentaje con una media de 5,40%; donde el mejor nivel de utilización el T1, recomendando la adición de 1,5 mg CLC en medios de crioconservación ya que de acuerdo a los resultados obtenidos se espera obtener mejores parámetros reproductivos.The objective of this study was to evaluate post-thaw sperm quality in the face of the effect of addition of cholesterol-loaded cyclodextrin (CLC) in the cryopreservation medium. The research was carried out in the Animal Reproduction Laboratory at the animal Sciences Faculty at ESPOCH, using a single 3-year-old Jersey breeder from the "San Diego" Livestock, an artificial vagina was used for a total of 5 collections, macroscopic characteristics were: (color: whitish with a slightly creamy appearance, volume: 8ml, pH: 6.78) and microscopic (concentration: 1040x106 spz/ml, mass motility: 4 points, individual motility: 87% and normal morphology: 87%). The pre-diluted semen was divided into 3 equal parts adding the CLC for their respective treatments (T0:0 mg, T1:1.5 mg, T2:3.0 mg) which were incubated at 37ºC for 15 minutes, after this time the final dilution was carried out by packing them immediately into 0.5 ml straws, taking them to the automatic freezer, lowering the temperature progressively down to -196ºC and storing them in the liquid nitrogen tank, the straws were thawed every 7 days for their respective evaluation. A Complete Design Was Used Randomly obtaining significant differences P(<0.01) for motility, vitality and integrity of the membrane with means of 63.50%; 75.36%; 60.08% respectively belonging to T1, in terms of morphoanomalies no statistical differences were found, being T2 the one that presented the greatest percentage with an average of 5.40%; where the best level of use was T1, recommending the addition of 1.5 mg CLC in cryopreservation media according to the results obtained better reproductive parameters are expected

Efecto de la adición de un surfactante natural (aloe vera) al diluyente triladyl® para crioconservación de semen bovino en toros reproductores de agso-genes, Quito-Pichincha.

La gran ventaja de la inseminación artificial es el aprovechamiento del potencial genético de reproductores de excelentes características para diseminar estas cualidades en pos de mejorar la genética. Durante muchos años especialmente en el siglo anterior se desarrollaron sistemas de colecta y procesamiento de semen bovino, así mismo se han tecnificando los protocolos de inseminación en condiciones comerciales. En el Ecuador la Inseminación artificial bovina no es una técnica ajena y en los últimos años su uso y tecnificación ha mejorado significativamente

Nuevos métodos integrados de evaluación de la calidad seminal en vacuno

[EN] he general aim of the present study was to apply a method of fluorescent multiple analysis developed by the group TECNOGAM in the study of the motility and morphometry of the spermatic subpopulations and improving hypo - osmotic test . Three studies were conducted using frozen semen of Friesian bulls as animal model . In three studies the image analysis was conducte d with the ImageJ free software, and the statistical analysis of the data using the analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey's test. In the s tudy 1 , the percentage motile sperm atozoa in the fluorescent subpopulations was determined . The fluorochromes allowed a rapi d determination of the plasma membrane and acrosome integ rity of sperm . The subpopulation with intact plasma membrane and acrosome displayed a hi gher percentage of mot ile sperm with the damaged membrane were motile. In the stud y 2, the morphometric parameters of the head, nucleus and acrosome of the sperm subpopulations and of 3 treatments: liquid samples immobilized with formaldehyde (1) and with shock for heat 65°C - Trumorph® (2), dried, fixed smears dyed with IP/PSA (3) were compared. The area of the head, nucleus and acrosome were lower (P <0,05) in smears than it wet mounts treatment s. However, no significant differences in the sperm morphometry of the two treatments in the wet mounts were found. The subpopulation with acrosome normal, damaged membra ne presented significantly higher measures (P <0,05) compared with the subpopulation with acrosome normal, membrane intact , for both treatments in wet mounts. The percentage of t he head occupied by the acrosome in the smears wereas higher that those of the treatments in wet mounts. Finally, in the study 3, the effect of hypos - osmotic test (HOST), two types of solu tions based on citrate and TRIS , a nd the test water ( WT) on t he distribution of the sperm subpo pulations. The final osmolarity was adjusted to 150 mOsm/kg in all the cases. The pH was adjusted to 7.0 based only on the TRIS solution . The subpopulations were determined at 5 and 40 min from incubation to 37°C. The response to HOST, the state and acrosome membrane integrit y were used to establish eight subpopulations . For both periods of incubation, the subpo pulation HOST negative, acrosome damaged, damaged membrane was significantly higher in the WT that in both HOST solutions evaluated (P <0.05). At 40 min, the subpop ulat ion, HOST positive, acrosome i ntact, intact membrane was lower in the WT t hat in the HOST when citrate - based solution was used . The new met hod of multiple fluorescent staining allowed, for the first time, to study in the same sperm atozoa the integrity of the plasma membrane and acrosome, functionality and motility, obtaining diffe rent the sperm subpopulations. The ability of these new methods of analysis to predict sperm fertility will be addressed in future studies.[ES] Se trabajará sobre el desarrollo de nuevos métodos de evaluación de la calidad seminal en rumiantes, que estarán basados en una tinción múltiple fluorescente del espermatozoide, lo que permitirá evaluar simultáneamente diferentes parámetros con relevancia funcional y, potencialmente, mejorar la capacidad predictiva de la fertilidad del semenSánchez Caycho, KL. (2016). Nuevos métodos integrados de evaluación de la calidad seminal en vacuno. http://hdl.handle.net/10251/66376TFG

Determinación de la concentración óptima de distintos agentes crioprotectores para la criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca

Determina la concentración óptima del glicerol, etilenglicol y dimetil sulfóxido en la criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca. El análisis estadístico de los tres primeros experimentos se realiza mediante un modelo de regresión polinomial quíntuple, se obtiene la concentración óptima de 1.16, 1.02 y 0.9 M para el glicerol, etilenglicol y dimetil sulfóxido respectivamente. El cuarto experimento determina cuál de los crioprotectores criopreservaba mejor la motilidad, integridad de membrana plasmática y viabilidad e integridad acrosomal de los espermatozoides epididimarios. Está conformado por las concentraciones óptimas de los tres crioprotectores y en este se utiliza un análisis de varianza, además de la Prueba de Tukey. Concluye que las concentraciones de 0.9 M de DMSO y 1.16 M de glicerol conservan mejor las características espermáticas antes mencionadas a diferencia de la concentración de 1.02 M de etilenglicol.Tesi

Valoración mediante imágenes digitales del semen descongelado de verraco

328 p.En el presente trabajo hemos aplicado las nuevas técnicas de análisis seminal mediante imágenes digitales al proceso de criopreservación espermática en la especie porcina, con la intención de incrementar los conocimientos que tenemos sobre el mismo y mejorar nuestra capacidad para estimar la congelabilidad de los eyaculado